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Le traitement en aval reste l’une des étapes les plus chronophages et les plus exigeantes en main-d’œuvre dans la fabrication pharmaceutique. En se concentrant particulièrement sur la chromatographie, qui permet de séparer et de traiter l’API, la protéine ou le fragment, cette technique offre une opportunité prometteuse et significative de réduire les coûts et le temps de traitement, d’améliorer l’efficacité et d’optimiser les processus. La chromatographie à flux radial permet d’accomplir bien plus avec moins.
Qu’est-ce que la chromatographie à flux radial ?
Pour comprendre comment fonctionne la technologie de chromatographie à flux radial et comment elle peut précisément bénéficier à la plupart des applications actuelles de purification en aval, il est nécessaire d’examiner son mode de fonctionnement et en quoi il diffère de la technologie de colonne traditionnelle ou axiale.
La première différence notable par rapport aux colonnes à flux axial largement connues réside dans la distribution du flux à travers le lit chromatographique et la colonne. En chromatographie axiale, l’écoulement peut être aussi simple qu’un « écoulement gravitationnel », où le fluide se déplace du haut vers le bas de la colonne sous l’effet de la gravité, et aussi complexe qu’un système sophistiqué de distribution au niveau du couvercle supérieur au sommet de la colonne axiale pour assurer une répartition uniforme de l’échantillon lors de l’entrée dans le lit chromatographique court mais large (en chromatographie préparative/industrielle). En chromatographie à flux radial toutefois, l’échantillon traverse le lit chromatographique de manière horizontale. L’éluant/échantillon entre par le haut de la colonne, où le couvercle agit comme une tête de distribution et dirige l’échantillon dans l’espace entre le corps extérieur de la colonne et le disque fritté extérieur.
L’échantillon est réparti sur toute la hauteur de la colonne et s’écoule horizontalement du disque fritté extérieur vers le noyau interne. Depuis l’espace entre le disque fritté intérieur et la tige collectrice (séparateur au centre de la colonne), l’éluant quitte la colonne par la sortie située en bas. La hauteur effective du lit chromatographique de la colonne correspond à la distance entre le disque fritté intérieur et le disque fritté extérieur. Cela entraîne une hauteur de lit fixe, contrairement aux systèmes utilisant un piston, souvent présents sur les colonnes axiales. Bien qu’il soit nécessaire d’avoir à disposition une certaine quantité de résine chromatographique (généralement 120 % du volume nominal de la colonne) pour toute expérience de séparation avec une colonne à flux radial, la longueur du lit et le volume étant fixes (sans piston pour sceller le haut de la colonne), toute expérience de séparation reste hautement reproductible. De plus, une fois validés, les conditions et le volume de séparation de la colonne respective restent constants, sans marge d’erreur et sans nécessiter de réajustement du lit chromatographique.
Le principe de la chromatographie à flux radial a été développé et breveté par Sepragen dès 1985. Les colonnes de chromatographie à flux radial SuperFlo de Sepragen se distinguent par leur grande efficacité et leur processus de remplissage extrêmement rapide et simple (voir « Comment sont remplies les colonnes à flux radial ? »). En outre, les processus sont facilement évolutifs en fonction de l’échelle de production (voir « Comment fonctionne la mise à l’échelle pour la production ? »). Les colonnes de chromatographie à flux radial SuperFlo de Sepragen sont fabriquées en acrylique ou en acier inoxydable et sont disponibles en capacités allant de 50 ml à 1 500 ml pour l’échelle de laboratoire et de 5 l à 500 l pour la production.
Quelle est la différence entre les colonnes de chromatographie à flux radial et les colonnes axiales ?
La force motrice de ce type de chromatographie est la différence de pression entre le disque fritté intérieur (plus petit) et le disque fritté extérieur (plus grand), combinée à leur différence de surface correspondante, ce qui entraîne un différentiel de vitesse. Avec l’augmentation du flux à travers la surface respective en direction du centre de la colonne, l’extrémité postérieure/interne du lit présente une contre-pression plus élevée que les parties antérieures/externes du lit, ce qui permet aux solutés de traverser le lit de manière horizontale et précise. Avec une augmentation significative des surfaces de contact par rapport aux colonnes axiales, cette conception permet des flux plus élevés avec des vitesses linéaires similaires, ce qui maintient le temps d’interaction entre la phase solide et l’éluant. Un autre point important de différence entre chromatographie à flux axial/radial qu’il convient de mentionner concerne la répartition du flux d’éluant. Alors que les colonnes axiales (de grande taille) nécessitent une distribution souvent complexe du flux à travers la tête d’entrée avant de pénétrer dans le lit chromatographique via le premier disque fritté, en chromatographie radiale, la position à laquelle la molécule d’éluant pénètre dans le lit chromatographique est sans importance, car la condition/le temps de séparation et la distribution restent identiques à ceux de toute autre molécule d’éluant. En l’absence d’autre technologie de distribution potentiellement en échec/obstruée, la distribution de l’éluant dans le lit de la colonne à flux axial génère une courbe de Gauss plus large, car emprunter la voie la plus courte et la plus rapide à travers la tête d’entrée, le lit chromatographique et la tête de sortie peut considérablement différer d’emprunter la voie la plus large et la plus lente (extrémités externes de la colonne). Cela entraîne une résolution de séparation inférieure et des difficultés à détecter les défauts potentiels du lit chromatographique. En chromatographie à flux radial, l’éluant se déplace toujours horizontalement dans le lit chromatographique. De plus, la somme du trajet entre la tête d’entrée et l’entrée dans le lit chromatographique, et du trajet entre la sortie du lit chromatographique et la tête de sortie étant toujours constante, cette conception de colonne bénéficie d’une résolution supérieure.
Comment la chromatographie à flux radial accélère-t-elle mon processus ?
Comme brièvement mentionné dans la conception de la colonne, la plus grande surface avec un lit généralement court (comme c’est souvent le cas en chromatographie préparative) permet une distribution plus homogène de l’éluant, une contre-pression beaucoup plus faible à une vitesse linéaire constante et, par conséquent, une possibilité d’accélérer considérablement la séparation d’une même taille. Cet effet est encore plus marqué lorsque certaines étapes du processus ne nécessitent pas d’être limitées par une certaine vitesse linéaire, comme l’équilibrage de la colonne avec la phase mobile et éventuellement les étapes de lavage entre le chargement et l’élution de l’échantillon d’intérêt.
L’étude de cas suivante explore le potentiel de gain de temps grâce aux caractéristiques uniques du flux radial dans la purification d’une enzyme bactérienne intracellulaire. Bien que la colonne utilisée ici ait un volume beaucoup plus important que celle à flux axial, la hauteur du lit reste constante, ce qui entraîne des paramètres de séparation similaires. Avec une surface beaucoup plus grande et une contre-pression faible, la colonne à flux radial permet d’achever l’ensemble du processus de séparation en moins de la moitié du temps. Cela prend en compte un flux d’élution constant (par volume de colonne) ainsi que les avantages d’un flux plus rapide lors du lavage et de l’équilibrage. Le flux maximal ici est près de sept fois plus élevé, démontrant ainsi les capacités significatives de l’utilisation du flux radial dans tout type de processus chromatographique impliquant une interaction chimique entre la phase mobile et la phase stationnaire. De plus, non seulement le temps de traitement est réduit, mais le rendement est amélioré grâce à la réduction de la dégradation protéolytique sur colonne, ce qui entraîne une augmentation de 10 % de la capacité de chargement.
Comment la chromatographie à flux radial permet-elle d’économiser de la résine ?
Nous avons établi l’avantage inhérent que possède la conception à flux radial en termes de temps de traitement et de limitations en matière de pression ou de vitesse linéaire. Cela peut entraîner un flux beaucoup plus élevé tout en conservant une taille de colonne similaire, si une augmentation de la quantité de produit est souhaitée. Cependant, les paramètres physiques peuvent également être exploités pour maintenir un flux similaire tout en réduisant l’investissement en matériel. Autrement dit, en réduisant la taille de la colonne tout en conservant le même rendement, il est possible de réduire la quantité de résine, les heures de travail et l’empreinte de la colonne. À titre d’exemple, une purification de 200 l/h pourrait être réalisée soit avec une colonne à flux axial de 160 l en trois équipes, soit avec une colonne à flux radial de 60 l en une seule équipe.
Une autre application courante de la chromatographie à flux radial l’a démontré, conjointement avec des entreprises pharmaceutiques expertes, il est possible de réduire le coût du processus avec le fractionnement du plasma sanguin. Les données ci-dessous proviennent d’une installation de fractionnement du plasma. L’étude a été menée dans le but de comparer la performance d’une colonne à flux radial de 20 l à celle d’une colonne à flux axial de 16 l. Avec l’utilisation de la chromatographie à flux radial, les flux ont été multipliés par plus de trois, ce qui a permis de réduire le temps de séparation de trois équipes à une seule, sans affecter le rendement ou la pureté du produit. Les coûts présentés ici sont des estimations, mais en réduisant la taille de la colonne (volume) de plus de moitié par rapport à l’investissement initial (et aux retours), les économies potentielles sont considérables.
Comment fonctionne la mise à l’échelle pour la production ?
Un facteur clé du développement en aval est la mise à l’échelle. Une fois établis à l’échelle de recherche, les protocoles doivent être ajustés, testés et validés à une plus grande échelle pour permettre l’augmentation de la production et répondre aux exigences du processus et du taux de récolte. À mesure que les tailles de colonnes augmentent, la hauteur du lit change généralement, ce qui complique la transposition du processus de recherche à l’échelle industrielle. Avec le changement de surface des disques frittés (par volume), la vitesse linéaire doit être réévaluée. Avec l’augmentation de la longueur du lit, la contre-pression, le flux et la précision de séparation doivent être surveillés de près et même ajustés.
Une innovation clé pour résoudre ces potentielles inexactitudes avec la chromatographie à flux radial est l’utilisation de la colonne Wedge. Comme son nom anglais l’indique (wedge = part), il s’agit d’un segment découpé d’une colonne radiale complète, tout en conservant une hauteur de lit et un ratio de surface du disque fritté interne vers externe constants et comparables à une colonne à flux radial complète à une échelle de production. Ainsi, le volume est réduit en fonction de la hauteur totale de la colonne et de l’angle du segment par rapport à la conception à 360° d’une colonne à flux radial complète. Cela signifie que tous les paramètres de séparation restent identiques au cours du processus de mise à l’échelle, tant que le flux est ajusté par le même facteur que le volume de la colonne finale à plus grande échelle. Dans l’étude de cas, la même concentration de sérum bovin a été chargée sur des colonnes de tailles différentes. L’une est une colonne Wedge de 400 ml, l’autre une colonne à flux radial complète de 12 l, entraînant un facteur de mise à l’échelle de 30. En multipliant simplement la taille de l’échantillon et le flux par ce facteur, la colonne Wedge donne un chromatogramme superposable à celui obtenu dans le test final avec la colonne réelle.
Comment les colonnes à flux radial sont-elles remplies ?
Avec le volume de colonne fixe mentionné précédemment en chromatographie à flux radial, qui en fait une conception bien plus reproductible et fiable, le remplissage efficace ne dépend pas des compétences ou de l’expérience du technicien concerné, mais uniquement de la compressibilité du support de remplissage et de sa pression finale de remplissage. En tenant compte de la compressibilité de la résine, le facteur déterminant reste la pression. Toutefois, ce processus peut être automatisé afin de maximiser la reproductibilité et de minimiser l’intervention de l’utilisateur afin également de lui libérer du temps pour d’autres tâches.
Le remplissage d’une colonne à flux radial SuperFlo est standardisé : la colonne est d’abord remplie par le port de sortie avec un tampon de remplissage afin de chasser l’air résiduel via les ports de remplissage (situés en haut de la colonne pour que l’élimination de l’air soit intuitive et simple). Ensuite, le flux est inversé afin de pomper activement la suspension contenant la résine dans la colonne via les ports de remplissage respectifs mentionnés précédemment. Le tampon contenu dans le cylindre de la colonne est alors remplacé par la résine (pour la chromatographie à échange d’ions, la résine SepraFlo est recommandée) et expulsé, généralement, via le disque fritté extérieur de la colonne, en raison de sa plus grande surface. Ce procédé garantit une compression uniforme du lit chromatographique, qui contient désormais la résine.
En pompant activement la suspension dans la colonne, une pression et une compression uniformes de la colonne sont facilement atteignables sans nécessiter d’ajustements rétroactifs (comme cela est souvent le cas avec un piston utilisé dans les colonnes à flux axial). Le remplissage assisté par pompe, effectué depuis le haut, permet un remplissage actif à une pression finale de remplissage déterminée uniquement par le support chromatographique, offrant ainsi une grande flexibilité quant au choix de la pompe. Le flux de la pompe influence uniquement la vitesse de remplissage de la colonne et n’a aucune incidence sur l’intégrité du lit chromatographique ou sur la capacité à atteindre un seuil de pression défini. Bien entendu, les techniques classiques d’optimisation du remplissage restent valables lors du remplissage d’une colonne à flux radial SuperFlo. À titre d’exemple, l’optimisation du remplissage avec un support de HIC (hydrophobic interaction chromatography, chromatographie d’interaction hydrophobe) classique, à base d’agarose hautement compressible, a donné les meilleurs résultats lorsqu’un ajout préalable de sel a été effectué pour prérétrécir ou compacter le support avant le remplissage proprement dit et le déplacement du tampon par un remplissage actif sur les deux disques frittés. Avec ces matériaux compressibles, une suspension diluée s’est avérée efficace et a révélé une concentration initiale de 25 % (v/v) pour cette optimisation de remplissage, permettant ainsi une dilution continue de la suspension avec le tampon déplacé à l’intérieur de la colonne. De cette manière, la taille, la vitesse et la puissance de la pompe restent gérables, même pour les grandes colonnes et les matériaux compressibles, garantissant intégrité, reproductibilité et facilité d’utilisation, quel que soit le type d’application, de matériau ou de taille de colonne requis.
Résumé
Les avantages de la colonne à flux radial SuperFlo de Sepragen, inventeur de la technologie du flux radial, incluent les suivants :
- Un remplissage reproductible et automatisable,
- Une distribution du flux plus homogène et plus précise,
- Des flux plus élevés tout en maintenant des vitesses linéaires essentielles,
- Des contre-pressions plus faibles,
- Une séparation améliorée.
Avec des matériaux disponibles en acrylique et en acier inoxydable, dans une gamme allant de 50 ml à 500 l et plus, la conception des colonnes est illimitée, répondant ainsi à toutes les exigences des applications chromatographiques impliquant des interactions chimiques. Les colonnes Wedge sont disponibles à partir de 20 ml, permettant une mise à l’échelle facile et progressive, et facilitant ainsi l’exploration de la séparation grâce à la technologie à flux radial SuperFlo. Bien que des tailles standardisées existent et aient fait leurs preuves dans l’industrie en restant fiables et opérationnelles à long terme, des options personnalisées sont disponibles pour la taille de la colonne et la hauteur du lit chromatographique, ainsi que pour les matériaux de fabrication de la colonne, les connecteurs et les finitions de surface.
Comment transposer un processus de chromatographie axiale vers la chromatographie radiale ?
En règle générale, lors du transfert ou de la mise à l’échelle d’un processus avec un changement de la hauteur du lit, ce qui n’est pas inhabituel dans le cadre des processus de chromatographie à flux radial, le facteur de séparation qui ancre le transfert à une constante est le temps de séjour ou le temps dont dispose l’éluant pour une interaction avec la phase stationnaire (ou plutôt une distribution généralement normale). Une séparation similaire dans le cadre d’une expérience à faible échelle peut toutefois avoir lieu à condition que l’interaction entre l’éluant et la phase stationnaire soit suffisamment longue, haute, fréquente. Le lit chromatographique étant défini par ingénierie et ne pouvant pas être modifié, le paramètre restant pour estimer et cibler un délai de séjour défini est la vitesse linéaire mentionnée précédemment. Ce paramètre essentiel n’étant pas constant à travers le lit chromatographique dans le cadre de la technologie à flux radial, les extrêmes peuvent être sélectionnés en tant que flux à travers la surface de la zone du disque fritté interne (vitesse linéaire la plus élevée par volume = temps de séjour le plus court) ou du disque fritté externe (vitesse linéaire la plus basse). Le plus souvent, et pour plus de commodité, la vitesse linéaire/le flux le plus souhaitable peut être estimé comme un anneau dans le lit chromatographique, entre les deux disques frittés, maintenu et, le cas échéant, mis à l’échelle en maintenant à l’identique la hauteur du lit et la technologie de la colonne. Avec une distribution non linéaire de la vitesse linéaire, la technologie à flux radial est le gage d’une fidélité et d’une flexibilité optimales du processus avec sa conception et ses attributs physiques.